0 引言 Introduction

全球范围内，每年因创伤、感染、肿瘤等因素需进行骨移植手术的患者超过200 万人次[1]，临床对于有效骨缺损治疗的需求也不断增加。尽管自体骨移植一直是骨修复的金标准[2]，但由于自体骨移植通常会给患者增加痛苦，且其来源也在大段骨缺损时受到限制，因此其应用也受到了一定的限制[3]。

组织工程学涵盖了生物学、医学、工程学等新兴多学科综合研究领域，它的目的在于探究细胞、组织中结构和功能之间的关系，并开发可以修复或替换受损组织、器官和(或)人体部分的生物替代物。一般认为，组织工程学的成功需要3 个组成部分的相互作用：生物材料作为支架、用于新组织生成的种子细胞以及指导种子细胞形成所需的组织生物信号分子[4]。

β-磷酸三钙属于β 相中的磷酸三钙家族。相较于羟基磷灰石，β-磷酸三钙更容易再吸收，植入骨骼时具有很高的生物相容性[5]，同时β-磷酸三钙的基本晶粒因烧结而具有微孔性(＜100 μm)，这促进了Ca2+和PO43-的细胞外交换，从而增加了成骨细胞的聚集生长和新骨沉积，这些特性使其成为一种可靠的组织工程材料，但β-磷酸三钙具有轻微的脆性，往往因为无法抵抗疲劳而造成材料内部断裂。

壳聚糖是甲壳素的脱乙酰化产物，是常用于组织工程支架制备的天然聚合物材料。壳聚糖作为少数几种在主链中具有游离胺基团的天然聚合物之一，它的这种连接侧基团为多功能材料的制造提供了可能性，并且可以改变这些材料的生物学和/或物理性质[6]。

课题组拟将壳聚糖与β-磷酸三钙混合，以期制备出孔隙率高、材料结构稳定、孔径适合成骨细胞生长、具有较好骨诱导性的水凝胶材料，并探究不同比例的β-磷酸三钙和壳聚糖形成的水凝胶对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)生长与矿化的影响，希望通过对其理化结构、生物相容性及成骨机制的相关研究，探索一种适合成骨细胞生长且成骨更为理想的材料，为今后组织工程学应用于骨缺损修复打下基础。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 体外观察性实验。

1.2 时间及地点 实验于2016 年9 月至2019 年6 月在南方医科大学口腔医院实验室完成。

1.3 材料 壳聚糖(脱乙酰度≥95%，上海麦克林生化科技有限公司)；β-磷酸三钙(生物医用级，β 相磷酸三钙≥98%，粒径＜ 0.1 μm，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；京尼平(纯度＞98%，大连美仑生物技术有限公司)；β-甘油磷酸钠(纯度≥99.0%，美国Sigma 公司)；无水乙醇(广州化学试剂厂)；盐酸(广州化学试剂厂)；电热恒温水浴锅(HWS-12，上海一恒科学仪器有限公司)；生化培养箱(SPX-1508-Z，上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；精密电子天平(MS603S，上海天能科技有限公司)；磁力搅拌机(JB-2，上海雷磁新径仪器有限公司)；二氧化碳培养孵育箱(德国GMBH 公司)；光学显微镜(日本OLYMPUS 公司)；倒置显微镜及照相系统(IX51，日本OLYMPUS 公司)；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；移液枪(德国Eppendorf 公司)；细胞培养皿(美国Corning 公司)；CellTiter-Lumi?发光法细胞活力检测试剂盒(碧云天)；DMEM 培养基、胎牛血清、双抗、胰酶(美国Sigma 公司)；OriCell 人牙髓干细胞成骨诱导分化培养基试剂盒(美国Cyagen Biosciences 公司)。

1.4 方法

1.4.1 水凝胶的制备 称取适量壳聚糖粉末溶解于配置好的0.1 mol/L 盐酸溶液；称取适量β-甘油磷酸钠溶于超纯水中；称取适量京尼平溶于超纯水中。称取适量β-磷酸三钙溶于2%壳聚糖溶液中，使其与壳聚糖溶液的质量体积比分别为0.5%，1%及2%，逐滴加入β-甘油磷酸钠溶液，直到pH 值达到中性，搅拌均匀后逐滴加入京尼平溶液，待气泡排除后将水凝胶接入离心管、6 孔板、96 孔板中，37 ℃生化培养箱交联24 h。以上操作皆在无菌条件、4 ℃冰水浴下进行。

1.4.2 电镜观察 将各组水凝胶冻干后裁剪为1 cm×1 cm×0.3 cm 的相等大小立方体，使用扫描电子显微镜观察断面的内部结构和形貌，选取10 个随机区域以平均值计算孔径大小。

1.4.3 孔隙率测定 在恒温恒压的条件下，首先选取适当大小的称量瓶，倒入适量乙醇，将大小已剪裁好的一定体积的待测支架材料(干质量为m0)，浸入容量瓶中直至完全浸透，称取称量瓶质量记为ma，将已经浸透的湿支架取出，称得称量瓶的质量为mb。选取50 mL 的比重瓶，装满乙醇溶液至刻度后称质量，记为m1，将已经浸透乙醇的湿支架材料放入容量瓶，继续加入乙醇至比重瓶规定刻度，称质量记为m2。