牙周炎是以牙周支持组织炎症和破坏为特征的感染性疾病。牙周治疗终目的是牙周支持组织的再生与功能重建。牙囊细胞（dental folic cells，DFCs）自我增殖能力强，具有多向分化的潜能，可分化为成骨细胞、成牙骨质细胞、牙周膜细胞（periodontal ligament cells，PDLCs），利于牙周软硬组织的再生与重建，是牙周组织再生工程中研究较为广泛的种子细胞［1］。本课题组前期研究发现牙龈卟啉单胞菌来源的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）对DFCs 以及PDLCs 的分化作用是不同的。当LPS预处理DFCs 24 h 后，DFCs 膜片能够上调成骨、成纤维相关基因如碱性磷酸酶、骨钙素、Ⅲ型胶原（Collagen Ⅲ，Col Ⅲ）的表达，同时对黏附相关基因骨膜蛋白的表达无影响；然而，经LPS 刺激后的PDLCs 膜片则表现为成纤维、成骨以及黏附相关基因表达的下调，不利于牙周组织再生。因此，DFCs相较于PDLCs 具有抵抗LPS 刺激调节炎性微环境的能力，利于分化形成完整的牙周组织结构［2］。然而，LPS 预处理后的DFCs 促进牙周组织再生的机制尚不明确。外泌体是由细胞分泌的胞外囊泡，直径为30～100 nm，主要以内出芽的形式产生［3］。与细胞分泌的生长因子不同的是外泌体包裹着丰富的来源细胞的蛋白质、核糖核酸、微小核糖核［4］，具有靶向性，并且这些重要组份使外泌体在疾病的免疫调控［5］、组织损伤修复［6］以及临床疾病检测与诊断［7］等过程中发挥重要作用。近期研究发现，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）可以通过旁分泌机制分泌外泌体替代MSCs 发挥促进组织缺损修复及骨再生的作用［8］。本实验旨在探究LPS 预处理DFCs 分泌的外泌体（LPS pretreated DFCs derived exosomes，L-Exos）浓度在10 μg/mL 以及100 μg/mL 时对牙周炎患者的牙周膜细胞（periodontal ligament cells of periodontitis，p-PDLCs）成骨分化功能的影响。为L-Exos 作为替代细胞疗法用于牙周组织再生提供实验基础。

1 材料和方法

1.1 主要材料和试剂

胎牛血清（Gibco，美国）；α-MEM 完全培养液（GE Healthcare Life Sciences，美国）；青链霉素（Solarbio，中国）；胰蛋白酶（Millipore，美国）；I 型胶原酶（Sigma，美国）；Trizol（Invitrogen，美国）；茜素红（Sigma，美国）；CD31、CD34、CD73、CD90、CD106、CD146 和Actin 抗体（Abcam，美国）；CD63 和Alix 抗体（正能，中国）；超滤管（Millipore，美国）；外泌体提取试剂盒（Invitrogen，美国）；扫描透镜（HT7700 TEM，日本）；纳米粒度及Zeta 电位分析仪（Malvern Instruments，英国）；高速离心机（Backman，美国）；Thermo Micro 21R 台式冷冻离心机（Eppendorf，德国）。本研究获得四川大学华西口腔医院伦理委员会批准，患者知情同意。

1.2 细胞培养与鉴定

1.2.1 DFCs 组织块酶消化法培养 取12～20 岁健康受试者需要拔除的未发育完全的智齿。收取包裹于牙冠的牙囊组织，置于10%双抗磷酸缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）中洗净，剪成0.5～1.0 mm 的细碎组织块，Ⅰ型胶原酶消化30 min，离心，弃上清，用含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）以及2%双抗的α-MEM 完全培养基洗涤，重悬。将组织平铺于T25 小瓶中，滴加少量含15%FBS 的α-MEM 培养基，置细胞孵箱中（5%CO2，37 ℃），24 h 后将培养基加至2 mL。每3 d 换液1次，应用倒置显微镜观察细胞状态，当细胞生长至60%～80%时用0.25%的胰蛋白酶消化传代，取第5代用于后续实验。

1.2.2 p-PDLCs组织块酶消化法培养 取40～60岁被诊断为慢性牙周炎的患者需要拔除的牙（牙周探诊深度大于4 mm，探诊出血且存在附着丧失），患者知情同意。拔除后置于10%含双抗的PBS 中，洗净。刮取收集根中1/3牙周膜组织于I型胶原酶中消化20～30 min，离心，用α-MEM 培养基洗涤，重悬，均匀平铺于小皿中，滴加少量15%FBS 的α-MEM 培养基，置细胞孵箱中（5%CO2，37 ℃），24 h 后将培养基缓慢加至2 mL。当细胞生长至80%时用0.25%的胰蛋白酶消化传代，取第3代用于后续实验。

1.2.3 DFCs 细胞表型鉴定 选用P3 代的DFCs，计数，细胞悬液分装至1.5 mL 的EP 管中，浓度为2 × 105个/200 μL，含2%FBS 的PBS 洗涤2 次后，每个离心管中加入2 μL 的CD31、CD34、CD73、CD90、CD106 和CD146 抗体在4 ℃下避光孵育1 h，含2%FBS 的PBS 洗涤2 遍。细胞悬液通过200 目的细胞筛，流式细胞仪检测。

1.3 LPS 刺激DFCs 并提取外泌体进行鉴定

P5 代的DFCs 置于T75 大瓶中培养至80%时，加入250 ng/mL LPS 24 h，PBS 清洗2 遍后，加入无血清培养48 h，收取细胞上清于50 mL 离心管中。于3 000 g 离心30 min，接着采用0.22 μm 的滤器过滤收集的上清，将过滤后的上清（分子粒径